H₂S含量測定試劑盒說明書

                                         微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

H₂S是一種新型氣態信號分子，存在于腦內的神經遞質，生理濃度的H₂S對神經系統海馬的長時程增強功能具有重要的調節作用，并對自發性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發揮著重要的病理生理效應。

測定原理：

H₂S與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應生成亞甲基藍，亞甲基藍在665nm處有最大吸收峰，通過測定其吸光值可計算H₂S含量。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、酶標儀、96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體16mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體8mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體1.5mL×1管，4℃避光保存。

樣品處理：

1.        組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清（漿）：直接測定。

操作表：

1、   酶標儀預熱30min，調節波長至665nm。

2、   操作表

H₂S含量計算公式：

用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為：y = 0.0022x，R² = 0.9988

（1）組織樣品

a.按照蛋白濃度計算

H₂S（nmol/mg prot）=×V反總÷(V樣×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr

b.按照樣本重量計算

H₂S（nmol/g 鮮重）=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)= 681.8×ΔA÷W

(3) 細胞

H₂S（nmol/10⁴ cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量(萬個)）=681.8×ΔA÷細胞數量（萬個）

（2）液體樣品H₂S（nmol/mL）=×V反總÷V樣= 681.8×ΔA

V反總：反應總體積，0.225mL；V樣：反應中樣品體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

注意事項：

Z低檢出限為1nmol/mL。