超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒說明書（WST-8 法）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微量法 100 管/96 樣

注　意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H2O2 主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理：

通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產生超氧陰離子(O2-)，O2-可與 WST-8 反應產生水溶性染料甲臜，后者在 450nm 處有吸收；SOD 可清除 O2-，從而抑制了甲臜的形成；反應液黃色越深，說明 SOD 活性愈低，反之活性越高。

需自備的儀器和用品：

酶標儀、離心機、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃避光保存；

試劑二：液體 150μL×1 支，4℃避光保存；

試劑三：液體 100μL×1 支，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 450nm。

2、 試劑三的稀釋：將試劑三用蒸餾水稀釋 50 倍，用多少配多少。（試劑三和蒸餾水 1：49稀釋。

3、 工作液配制：在試劑一加入 100μL 試劑二，充分混勻。配好的試劑 4℃避光可保存一周。（若一次性測定樣本較少，可按照實際用量將試劑一和試劑二按照 20mL：0.1mL 的比例混勻配制）

4、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解（溶解后一周內用完）。

5、 樣本測定（在 96 孔板中依次加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 30min 后，450nm 處測定各管吸光值 A。

注意事項：

1、試劑三為酶，不可冷凍，使用時在冰上放置。

2、對照管只需要做一管。

3、SOD 為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數值在什么范圍？

對照管的范圍是 0.4-1。對照管吸光值過低可能是（1）試劑三活性低，可以適當減少稀釋倍數；（2)沒有按順序加試劑；（3）反應時間不夠，可以延長反應時間（反應時間 30min可以延長到 40min）。對照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應倍數。若出現測定管大于對照管，可能是樣本中雜質的影響太大，為了降低雜質的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測，通常可以使測定正常。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

SOD 活性計算：

1、抑制百分率的計算

抑制百分率＝(A 對照管－A 測定管) ÷A 對照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內。如果計算出來的抑制百分率小于 10%或大于90%，則通常需要調整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當稀釋；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本。

2、SOD 酶活性單位：

3、在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應體系中抑制百分率為 50%時，反應體系中的 SOD 酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。

3、SOD 酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2）組織、細菌或培養(yǎng)細胞 SOD 活力計算：

a.按樣本蛋白濃度計算

SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)

=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

b.按樣本鮮重計算

SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W

c.按細菌或細胞個數計算

SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)

=0.04×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

V反總：反應體系總體積，0.2mL；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；

V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL ；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。