硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）活性測定試劑盒說明書

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微量法 100T/96S

注　意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

TPX 屬于過氧化物酶家族，在體內主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現抗氧化作用，功能與 GPX 類似，也是谷胱甘肽氧化還原循環關鍵酶之一。TPX 普遍存在于各種生物體內，如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細菌和古細菌，在進化上高度保守。 TPX 與細胞增殖、分化、細胞凋亡及腫瘤發生調控密切相關。TPX 的主要功能包括細胞脫毒、抗氧化和調節由過氧化氫介導的信號轉導和免疫反應。

測定原理：

TPX 催化 H2O2 氧化二硫蘇糖醇（DTT），H2O2 的吸收波長為 240nm，通過測定 240nm 吸光度的下降速率，即可計算出 TPX 活性。

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、和蒸餾水

試劑組成和配制:

試劑一：液體 120mL×1 瓶，室溫保存。

試劑二：液體 20mL×1 瓶，- 20℃保存。

試劑三：液體 2mL×1 支，4℃。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

TPX 測定操作：

取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 4 μL 上清液，180 μL 試劑二，16 μL 試劑三，迅速混勻后于 240 nm 測定 10s 和 130s 吸光度，記為 A1 和 A2。

TPX 活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個酶活單位。TPX（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=573×(A1－A2)÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個酶活單位。 TPX 活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每 10⁴ 個細胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個酶活單位。